对照条带大小一致，约600 bp，阳性率达100%，初步确定priDE-CTXA、priDE-CTXB和priDE-CTXC构建成功。
2.4重组质粒的PCR鉴定结果
从图4可看出，以从2.3阳性结果中随机挑选6个重组质粒为模板进行重组质粒PCR扩增，6个样品均能扩增出约600 bp片段，与阳性对照一致，证明重组载体构建成功。
2.5重组质粒的测序结果
从PCR鉴定呈阳性的6个重组质粒中随机挑选1个质粒进行测序，并对测序结果进行DNASTAR分析（图5～图7）。从图5可看出，priDE-CKXA质粒预期序列为CTKA standard Seq，靶点基因敲除后的预期序列为No-treatment Control Group Seq，序列分析CTXAstandard Seq与测序结果一致，priDE-CTXA重组质粒未发生突变，测序峰图对比的序列未出现异常，说明pHDE-CTXA重组载体构建成功。从图6可看出，pHDE-CTXB重组质粒预期序列为CTXB standardSeq，靶点基因敲除后的预期序列为No-treatmentControl Group Seq，序列分析CTXB standard Seq与测序结果一致，priDE-CTXB未发生突变，测序峰图对比的序列未出现异常，说明pHDE-CTXB重组载体构建成功。从图7可看出，priDE-CTXC重组质粒预期序列为CTXC standard Seq，靶点基因敲除后的预期序列为No-treatment Control Group Seq，序列分析CTXC standard Seq与测序结果一致，priDE-CTXC未发生突变，测序峰图对比的序列未出现异常，说明priDE-CTXC重组载体构建成功。
3讨论
用传统的克隆方法构建一个载体需对目的基因进行PCR扩增、胶回收、目的片段和载体酶切回收、连接转化及鉴定等操作，整个过程需耗时4～5 d（付莉莉等，2016）。本研究与其不同，采用同源重组技术进行重组质粒构建时无需回收插入片段和载体，组装时间短，整个过程仅需2-3 d，且重组质粒比率达100%，重组效率高。相对于传统的基因克隆技术，同源重组技术无须对PCR产物进行纯化、酶切等特殊处理，也不受酶切位点的限制，能在载体无法选择合适酶切位点时实现基因克隆；在引物设计时无需引入酶切位点的保护性碱基，避免对酶切效率产生影响，从而降低克隆失败的概率（Brooks，et a1.，2014）。
CRISPR是一种简单高效、能在全基因组水平上选择对目的基因调控表达的技术，与传统的RNA干扰技术（RNAi）相比，效率更高，用于开展基因功能研究更直接，获得的结论更可靠（Doudna and Char-pentier，2014），通过CRISPR干扰可沉默任意数量的单个基因（Mao et a1.，2017），對靶目标位点的选择也十分灵活，可实现对所有基因进行定点编辑（Mus-solino and Cathomen，2013；Brooks et al.，2014）。本研究结果也表明，根据Crisprscan找到目的基因的高评分靶点，利用Rgenome评估其脱靶情况，根据低脱靶高评分的靶点设计引物，用特异性引物扩增CTXA、CTXB和CTXC 3个目的片段，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，产物用低温冷冻法高速离心即得到纯化的CTXA、CTXB和CTXC片段，纯化后的片段在重组酶作用下与经Bsa I酶切后线性化的priDE载体相连接，重组子通过菌落PCR初步验证、重组子单克隆PCR验证及最后的测序验证，已成功构建priDE-CTXA、oHDE-CTXB和pHDE-CTXC 3个同源表达载体，可为桉树其他CRISPR/Cas9表达载体的构建提供借鉴，也可进一步利用根瘤农杆菌介导将CRISPR/Cas9转入巨尾桉的愈伤组织，获得转基因型愈伤组织或转基因尾巨桉，并通过检测突变材料中细胞分裂素合成酶的合成情况，验证CRISPR/Cas9表达载体的有效性，推动桉树分子育种技术及基因功能研究进程。
桉树是我国南方重要的工业用材林树种，具有速生、丰产特性及良好的经济、生态和社会效益（邓紫宇等，2016；Ouyang and Li，2016）。近年来，桉树再生及转化体系的高效建立及基因工程技术的成功应用，为定向改良其基因组成、研究相关基因功能奠定了基础。本研究使用高效基因组定向编辑的CRISPR/Cas9技术体系，无需引入外源基因，不存在转基因争议，生物安全性高（Hui et a1.，2014；Zhanget a1.，2016），为桉树材质改良、抗性育种提供了一种具有广阔应用前景的技术体系。
4结论
本研究利用pHDE-Cas9成功构建了巨桉CTX基因家族CRISPR载体，构建过程快速、高效，为桉树基因组定点编辑打下了基础，也可为其他桉树CRIS-PR/Cas9表达载体的构建提供借鉴。
（责任编辑 思利华）