摘要生物柴油由于其燃烧性高、污染小、可再生等优点,是传统化石燃料的理想替代能源,并已在世界范围内得到广泛应用。基因工程技术在生物柴油中的应用,主要集中在提高生物柴油原料的脂类含量上,如对含油植物和含油微藻的研究。结合国内外主要研究进展,综述了运用基因工程技术提高生物柴油原料脂类含量的8种途径,如超量表达乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶、苹果酸酶等。最后指出:将微藻作为生产原料是我国生物柴油产业发展的必然趋势,通过转录因子途径调控脂类的积累,是未来生物柴油产业发展的重要研究方向。
关键词基因工程;生物柴油;应用;脂类含量;微藻
中图分类号TE667文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)09-0022-03
TheApplicationofGeneEngineeringinBiodieselFeedstock
ZHENG Ming-gang 1SUI Jian-qiang 2ZHENG Li 1HAN Xiao-tian 3CUI Zhi-song 1
(1 Marine Ecology Research Center,Frist Institute of Oceanograhy,State Oceanic Administration,Qingdao Shandong 266061;2 Ocean University of China; 3 Institute of Oceanology,Chinese Academy of Science)
AbstractBiodiesel,due to its advantages of better burning performance,lower pollution,renewable feature etc.,is the ideal alternative energy source oftraditional fossil fuels and has been widely used in the world.The application of gene engineering in biodiesel production is mainly on improving the lipid content of biodiesel raw materials,such as oil plants and oil microalgae.In this paper,according to the research progress at home and abroad,the application of gene engineering in eight channels to improve the lipid content of biodiesel raw materials were reviewed.At last,it isconcluded that using microalgae as a feedstock is inevitable trend of biodiesel industry’s development in China.With the transcription factor pathway regulating lipid accumulation is an important research direction in the future development of biodiesel industry.
Key wordsgene engineering;biodiesel;application;lipid content;microalgae
社会的发展加速了人类对能源的消耗,能源问题已成为各国亟待解决的世界性问题。统计显示:全球石油探明储量仅供生产40年,这更为人类敲响了能源危机的警钟。此外,化石能源燃烧过程中会产生大量CO2,引起的温室效应将直接影响人类的生存环境。因此,为解决能源和环境问题,世界各国都在积极地寻找新能源,以应对将来可能发生的能源危机。生物柴油作为生物能源的一种,越来越得到各国的重视。与化石柴油相比,生物柴油具有闪点高、燃烧性高、污染小、可再生等优点,是化石燃料的理想替代能源[1]。
生物柴油原料的油脂含量是制约生物柴油发展的一大瓶颈。运用基因工程技术,克隆并特异性表达调控脂类合成相关酶的基因,从而提高生物脂肪酸含量并改变其组分以适应生物柴油发展的需要,是目前解决这一难题的有效手段。本文结合基因工程技术的应用现状,综述了基因工程在改造生物柴油原料中的研究进展,以期对生物柴油产业的发展提供一定指导。
1基因工程概述
基因工程,又称DNA重组技术,是指在基因水平上,以人工的方法取得目的基因,在体外重组于载体上,形成重组DNA分子,然后将重组DNA分子转入受体细胞进行复制、转录和翻译,从而产生人们所需要的目的基因的产物。基因工程技术打破了天然物种屏障,人们可以按照主观愿望,将来自不同生物体的DNA 片段组合到一起,并获得新的表达产物。
基因工程技术促进了生物学的迅猛发展,为解决生命科学领域的一些重大问题提供了强有力的手段,现已广泛应用于农业、医学、食品和环境保护等诸多领域。如培育抗虫、抗病、抗寒、抗旱农作物新品种,生产基因工程药物和可降解有毒物质的工程菌等。同样,在生物柴油的生产中,运用基因工程提高生物柴油原料的油脂含量,也逐步取代了传统方法,并取得了显著的效果。
2基因工程在生物柴油中的应用
生物柴油作为一种新型可再生能源,其生产原料主要为含油植物,如大豆、油菜、棕榈和蓖麻等。此外,将含油微藻作为生物柴油原料,也在逐渐成为一个新的研究领域。用微藻生产生物柴油具有更多优势,缪晓玲等[2]利用小球藻生产的生物柴油,不仅具有传统化石柴油相当的密度、粘度和热值,而且具有更低的冷滤点和良好的发动机低温启动性能。
迄今,基因工程技术在生物柴油中的应用,主要集中在提高含油植物的脂类含量上。虽然在含油微藻方面也有一些研究,但也主要借鉴对含油植物的研究方法。下面结合国内外主要研究方向,综述基因工程在提高生物柴油原料中脂类含量的研究进展。
2.1乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)
乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACCase)是脂肪酸生物合成的关键酶,它催化脂肪酸合成的第一步反应,即催化乙酰辅酶A生成丙二酸单酰辅酶A[3-6]。生物中的ACCase有2种类型:一是异质型,存在于细菌、双子叶植物和非禾本科单子叶植物等的质体中,由BC(生物素羧化酶)、BCCP(生物素羧基载体蛋白)、α型CT(羧基转移酶)和β型CT(羧基转移酶)等4个亚基组成[7-8];二是同质型,存在于动植物、酵母、藻类等的胞质溶胶中,由单亚基组成[9-12]。有研究表明,植物脂肪酸含量与ACCase的活性呈正相关。为了提高含油植物的脂肪酸含量,许多研究者进行了超量表达ACCase的试验。其中,Roesler等将一个叶绿体转移肽和napin启动子与拟南芥同质型ACC1基因融合,然后转化甘蓝型油菜。结果发现,转基因油菜的T1代成熟种子中ACCase的活性增加了1.7~1.9倍,总的含油量约增加了5%。由于ACCase过量表达,也改变了种子脂肪酸的组成[13]。Ohlrogge等[14]用同样的方法转化油菜,获得的转基因油菜T1代成熟种子中ACCase的活性增加了1.7~1.9倍,脂肪酸含量增加了6%。
许多学者研究了ACCase不同亚基在脂肪酸合成中的作用。Alisa等克隆和表达了油棕β-羧基转移酶基因(accD)和生物素羧化酶基因(accC),研究表明accD基因的表达在维持异质型ACCase的水平及植物种子的含油量中起着最重要的作用。这个研究也首次证明了高水平accD基因的表达,会产生高水平的含油量[15]。此外,Madoka等[16]、Kode等[17]分别采用超量表达和基因敲除技术方法研究了accD基因,结果显示accD基因编码的β-CT亚基是ACCase的限制因子。
对于含油微藻乙酰辅酶A羧化酶的研究比较少,Dunahay等[18]首次报道了含叶绿素微藻的遗传转化。在此试验中,他利用硅藻的遗传转化系统,超量表达ACCase基因(acc1),初步结果显示,转基因硅藻中ACCase的活性增加了2~3倍。
2.2脂肪酸合成酶(FAS)
脂肪酸合成过程中,乙酰辅酶A经乙酰辅酶A羧化酶催化转变为丙二酰辅酶A后,脂肪酸合成酶(FAS)就以丙二酰辅酶A为底物,继续进行脂肪酸的合成[19]。在植物中,FAS由ACP(酰基载体蛋白)和其他6种酶构成。其中,Dehesh等克隆了编码菠菜酮酰-ACP合酶(KASⅢ)的cDNA基因,使其在烟草、拟南芥和橄榄型油菜中超量表达。结果与正常植株相比,饱和脂肪酸(16∶0)都有所增加,不饱和脂肪酸含量下降[20]。
2.3酰基辅酶A:甘油二酯酰基转移酶(DGAT)
酰基辅酶A:甘油二酯酰基转移酶(acyl CoA:diacylgy-cerol acyltransferase,DGAT)是一种完整的内质网细胞微粒体酶,是催化三酰甘油(triacylgycerol,TAG)合成的最后一步反应的酶,也是甘油三酯合成过程中唯一的关键酶和限速酶。该酶的主要作用机制是使二酰甘油(diacylgycerol,DAG)加上脂肪酸酰基辅酶A形成三酰甘油[21-24]。Jako等首次在野生型拟南芥中,超量表达了种子特异性DGAT的cDNA,结果DGAT的活性增加了10%~70%,种子含油量也有显著增加[25]。Zhang等构建了特异hpRNA(具发夹结构的双链RNA),用它沉默烟草内源性DGAT1基因,转基因植株的成熟种子含油量下降了9%~49%[26]。
2.4乙酰辅酶A合成酶(ACS)
乙酰辅酶A合成酶不可逆的催化醋酸形成乙酰辅酶A,而乙酰辅酶A可以为脂类的合成提供原料。Roughan等发现乙酰辅酶A合成酶可以将醋酸转化为乙酰辅酶A,并进入脂类合成途径[27]。Lin等在大肠杆菌体内超量表达了其自身乙酰辅酶A合成酶基因(acs),与对照组相比,乙酰辅酶A合成酶的活性增加了9倍,同时也加速了脂类的生物合成[28]。
2.5ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)
ATP-柠檬酸裂解酶催化柠檬酸形成乙酰辅酶A和草酰乙酸,乙酰辅酶A可以为脂类的合成提供原料。Ratledge等研究了ACL的活性与甘蓝型油菜种子脂质积累的关系,发现在种子快速合成脂质过程中,ACL和乙酰辅酶A羧化酶一样,其活性达到最大[29]。Rangasamy等研究了老鼠肝脏ACL基因在烟草质体中的异源超量表达,结果表明超量表达老鼠ACL基因,使烟草质体中总ACL活性增加了4倍,脂肪酸的合成也增加了16%[30]。
2.6苹果酸酶(ME)
苹果酸酶以NADP+为辅酶,催化苹果酸脱氢产生丙酮酸和NADPH,NADPH可用为脂肪酸合成中的还原反应。于是有人提出通过超量表达苹果酸酶,为脂肪酸合成提供充足的还原动力,从而达到提高脂肪酸含量的目的。Wynn等[31]发现苹果酸酶为构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的脂质积累提供主要的还原动力NADPH。随后,Wynn等又进一步研究了NADPH与脂质积累之间的关系。即在丝状真菌中超量表达苹果酸酶,结果有大量NADPH生成,为脂类的合成提供了充足的还原动力,同时也增加了脂质的积累[32]。Zhang等在卷枝毛霉(Mucor circinelloides)中超量表达了苹果酸酶,结果发现苹果酸酶的活性增加了2~3倍,同时脂质的生物合成也增加了2.5倍[33]。
2.7β-氧化途径
脂肪酸的β-氧化途径,是生物体内脂肪酸降解的主要途径,它发生于原核生物的细胞溶胶及真核生物的线粒体基质中。因此,有研究者提出限制脂肪酸β-氧化途径的发生来提高含油植物的脂类含量。其中,Hara等用念珠菌研究了β-氧化途径中的关键酶——酰基辅酶A氧化酶,阻断对该酶所有基因的编码,并希望能增加二羧酸的生成。但结果相反,重组体念珠菌不能利用烷烃,也不能生产二羧酸[34]。由于直接对β-氧化途径关键酶的研究有一定的局限性,Cao等从酯酰辅酶A跨膜转运的角度,对提高念珠菌二羧酸生成进行了研究。在其研究中,通过对肉碱-酯酰转移酶(CAT)基因在重组体中的特异表达,发现当CAT的活性减少1/2时,二羧酸的产率增加了21.0%,对烷烃的转化能力增加了12.0%。但是,如果将CAT基因全部敲除,则重组体不能利用烷烃生产二羧酸[35]。
2.8磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPase)
许多研究者发现油菜蛋白质含量与油脂含量呈负相关,于是有人提出对应的反义技术调控植物油脂含量。陈锦清等[36]提出油脂和蛋白质的“底物竞争”假说,认为葡萄糖酵解产物——丙酮酸是油脂和蛋白质合成的共同底物,2种物质在合成中竞争丙酮酸。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)和丙酮酸羧化酶(PEPCase)分别是这2种物质合成的关键酶,它们的相对活性就决定了丙酮酸的流向。在这项研究中,他将根癌农杆菌EHA101携带反义PEP基因,然后转化甘蓝型油菜——浙油758和浙优油1号的下胚轴,成功地获得了转基因植株。对浙油758转基因植株的含油量测定显示,种子平均含油量比对照组高6.4%。对浙优油1号转基因植株的油脂及蛋白质含量测定表明,种子平均含油量比对照组高16.7%,其中1株油菜蛋白质含量下降9.7%。对转基因植株及对照组种子的油脂和蛋白质含量进行回归分析表明,2种植株的油脂和蛋白质含量呈显著负相关。张银波等构建了PEP基因的RNAi载体,希望通过抑制蛋白质的合成以使丙酮酸转向油脂的合成。由于RNAi技术的有效性及简易性,若该载体成功实现抑制目的基因,则可以为高油作物的培育开辟新的途径[37]。微藻PEPase的研究借鉴对含油植物的研究方法,其中宋东辉等采用反义PEP技术调控微藻PEPase的代谢途径,初步结果显示,反义抑制PEPase酶活性可以显著提高微藻脂类含量[1]。
3结语
生物柴油具有可再生、污染小、燃烧性高等优点,是一种新型环保可再生能源,具有极广阔的应用前景。目前,世界生物柴油的生产原料主要为含油植物,但根据我国食用油尚需大量进口的情况,不可能将植物油大规模用于生产生物柴油。而且我国土地资源有限,大幅度增加含油植物种植面积难度很大。因此,若要大规模发展我国生物柴油产业,必须寻找其他的生物柴油原料。利用微藻生产生物柴油可以很好地解决上述问题。微藻生长周期短,生长速率快,光合作用效率高,而且不占用农业用地,可以利用微生物发酵技术,在光反应器中高密度培养。因此,将微藻作为生产原料是我国生物柴油产业发展的必然趋势。
目前,国内外运用基因工程技术生产生物柴油还处于初级阶段,多采用单基因的特异表达提高脂类含量水平。但脂类的积累涉及到脂类的生物合成及分解代谢,是一个复杂的系统,不可能通过特异的表达一种基因来大大提高脂类含量。针对以上问题,已有学者提出转录因子途径调控脂类的积累。该途径的主要优势在于,转录因子参与调控代谢途径中的一系列基因。因此,可以通过调控相关转录因子,进而带动代谢途径中的一系列基因超量表达,使脂类水平大大提高。
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